核 酸・蛋白質科学研究室 (B) 主要研究テーマ
「真核生物の遺伝子相同組換えの分子機構の解明」
遺伝子の相同組換え(homologous recombination)の生化学的な側面からの研究を中心に行っています。

 生物は, 化学物質, 活性酸素, 紫外線, 宇宙からの放射線にさらされ、遺伝子(DNA)が傷ついています。その中でも重篤な傷害であるDNAの切断が起こったとき, DNAは主に相同組換えによって修復されています。また, 相同組換えは減数分裂のときにも行われ, 正常な配偶子形成に欠かすことができません。
 相同組換えのDNAレベルでの分子メカニズムは,(1) DNAの切断,(2) 相同なDNA鎖の検索対合,(3) 再結合の過程に分けることができます。その中で(2) の相同な(塩基配列の似ている)DNA鎖を探し出し対合する過程を「相同対合」(homologous pairing) と言います。
 私たちは、「細胞内の長大なゲノムDNAから如何に塩基配列の似ている部位を探し出すのか?」という点に着目しています。出芽酵母を材料として、まず相 同組 換えに関与している遺伝子から人工的にタンパク質を作り、それを精製単離します。続いて、それらのタンパク質と2種類のDNAを試験管の中で混ぜ合わせて 生体内での相同対合反応を再現させます。このような方法を用いて、相同組換えに関与している遺伝子から作り出されるタンパク質の機能を明らかにすることに よ り、相同組換えの分子メカニズムの解明を目指しています。将来は、生体内での相同組換えを制御することによって染色体レベルでの遺伝子操作を容易し、遺伝 病の治療に役立てたいと考えています。


  相同組換えは,(1) DNAの切断,(2) 相同な(塩基配列の似ている)DNA鎖を検索し対合,(3) 再結合の過程に分けることができます。その中で(2) の相同なDNA鎖を探し出し対合する過程を「相同対合」(homologous pairing) と言います。
 相同対合を試験管の中で解析するために、一本鎖DNA(ssDNA)と閉環状二本鎖DNA(form I)を基質とした反応系を使います。その反応系に組換えタンパク質(Rad52-Rad51など)を加えて相同対合が形成されると "D-loop" と呼ばれる構造体が形成されます(図右上)。
DL-detection
 相同 対合によって形成された D-loop は電気泳動により分析されます。一本鎖DNA(ssf)に放射性物質または蛍光物質で標識しておき、分析機械イメージアナライザーTyphoon9410 で解析して、D-loopの形成量を定量的に測定します。
 私たちは出芽酵母のRad51タンパク質とRad52タンパク質の両方がある時にD-loopが効率よ く形成されることを見いだしました。
(Arai, N. et al., J. Biol. Chem. 280, 32218-32229, 2005)
 組換 えタンパク質がDNAに結合すると、DNAに様々な構造変化を与えます。この変化をアガロースゲル電気泳動で分析した例です。
rad52-2ndDNA-bind
 私た ちは、理化学研究所と早稲田大学との共同研究によりRad51タンパク質とRad52タンパク質によるD-loop形成には、Rad52タンパク質の DNA結合部位が二本鎖DNAを捕まえることが重要であることを見いだしました。
(Arai, N., et al. J. Biol. Chem., 286, 17607-17617, 2011)
HsRad52
monomer  
HsRad52_11mer
11mer
HsRad52 (1-212)
from PDB 1kn0
 Rad52 タンパク質のN末端側の構造は、香川先生(現、明星大学)により明らかになり、リング構造を持っていることが解りました。(Dr. Kagawa et al. Mol. Cell, 10, 359 - 371, 2002)

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